Явление магнитного резонанса. Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР)
Метод электронного парамагнитного резонанса является основным методом для изучения парамагнитных частиц. К парамагнитным частицам, имеющим важное биологическое значение, относятся два основных типа - это свободные радикалы и комплексы металлов переменной валентности (таких, как Fe, Cu, Co, Ni, Mn).
Метод электронного парамагнитного резонанса был открыт в 1944 г. Е. К. Завойским при исследовании взаимодействия электромагнитного излучения микроволнового диапазона с солями металлов.
В основе метода ЭПР лежит поглощение электромагнитного излучения радиодиапазона неспаренными электронами, находящимися в магнитном поле.
Метод ЭПР позволяет нам изучать свойства парамагнитных центров посредством регистрации спектров поглощения электромагнитного излучения этими частицами. Зная характеристики спектров, можно судить о свойствах парамагнитных частиц.
К основным характеристикам спектров относятся амплитуда, ширина линии, g-фактор и сверхтонкая структура спектров.
Применение спиновых меток
Спиновые метки - химически стабильные парамагнитные молекулы, которые используются в качестве молекулярных зондов для изучения структуры и молекулярной подвижности различных физико-химических и биологических систем. Суть метода спиновых меток заключается в следующем. В исследуемую систему вводят в качестве спиновых зондов парамагнитные молекулы, которые дают характерные сигналы электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Сигналы ЭПР спиновых меток зависят от их молекулярной подвижности и физико-химических свойств ближайшего окружения. Поэтому, наблюдая за сигналами ЭПР молекулярных зондов, можно изучать структурные характеристики исследуемой системы и динамику происходящих в ней молекулярных процессов. Термин "спиновые метки" происходит от английского слова "spin" (веретено, волчок), которым называют собственный механический момент электрона. Электрон, как известно из квантовой механики, обладает механическим моментом, равным величине " /2, и собственным магнитным моментом, где " - постоянная Планка, e и m - заряд и масса электрона, с - скорость света. Парамагнитные свойства молекулярных зондов определяются наличием в них неспаренного электрона, обладающего спином и являющегося источником сигнала ЭПР. В качестве спиновых меток обычно используют стабильные нитроксильные радикалы. Все молекулы спиновых меток, несмотря на разнообразие их химического строения, как правило, содержат одинаковый парамагнитный фрагмент - химически стабильный нитроксильный радикал (>N-OJ). На этом радикале локализован неспаренный электрон, служащий источником сигнала ЭПР. Конкретный выбор спиновых меток определяется задачей исследования. Так, например, для того чтобы с помощью спиновых меток следить за конформационными перестройками белков, молекулы метки обычно "пришивают" к определенным участкам белка. В этом случае спиновая метка должна содержать специальную реакционную группу, которая может образовать ковалентную химическую связь с аминокислотными остатками молекулы белка. Для изучения свойств искусственных и биологических мембран обычно используют жирорастворимые спиновые метки, способные встраиваться в липидный слой мембраны.
Явление электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) заключается в резонансном поглощении электромагнитного излучения в диапазоне радиочастот веществами, помещенными в постоянное магнитное поле, и обусловленное квантовыми переходами между энергетическими подуровнями, связанными с наличием магнитного момента у электронных систем. Также ЭПР называют электронный спиновый резонанс (ЭСР), магнитный спиновый резонанс (МСР) и, среди специалистов, работающих с магнитно-упорядоченными системами, ферромагнитный резонанс (ФМР).
Явление ЭПР можно наблюдать на:
- * атомах и молекулах, которые на своих орбиталях имеют нечетное количество электронов -- H, N, NO2 и др.;
- * химических элементах в различных зарядовых состояниях, у которых не все электроны на внешних орбиталях участвуют в образовании химической связи - прежде всего, это d- и f-элементы;
- * свободных радикалах - метильный радикал, нитроксильные радикалы и др.;
- * электронных и дырочных дефектах, стабилизирующихся в матрице веществ, - O-, O2-, CO2-, CO23-, CO3-, CO33- и многих других;
- * молекулах с четным числом электронов, парамагнетизм которых обусловлен квантовыми явлениями распределения электронов по молекулярным орбиталям - О2;
- * наночастицах-суперпарамагнетиках, образующихся при растворении или в сплавах, обладающих коллективным магнитным моментом, которые ведут себя подобно электронному газу.
Структура и свойства спектров ЭПР
Поведение магнитных моментов в магнитном поле зависит от различных взаимодействий неспаренных электронов, как между собой, так и с ближайшим окружением. Важнейшими из них считаются спин-спиновые и спин-орбитальные взаимодействия, взаимодействия между неспаренными электронами и ядрами, на которых они локализуются (сверхтонкие взаимодействия), взаимодействия с электростатическим потенциалом, создаваемым ионами ближайшего окружения в месте локализации неспаренных электронов и другие. Большинство перечисленных взаимодействий приводит к закономерному расщеплению линий. В общем случае спектр ЭПР парамагнитного центра является многокомпонентным. Представление об иерархии основных расщеплений можно получить из следующей схемы (определения используемых обозначений даны ниже):
Основными характеристиками ЭПР-спектра парамагнитного центра (ПЦ) являются:
- * количество линий в спектре ЭПР конкретного ПЦ и их относительные интенсивности.
- * Тонкая структура (ТС). Число линий ТС определяется величиной спина S ПЦ и локальной симметрией электростатического поля ближайшего окружения, а относительные интегральные интенсивности определяются квантовым числом mS (величина проекции спина на направление магнитного поля). В кристаллах расстояние между линиями ТС зависит от величины потенциала кристаллического поля и его симметрии.
- * Сверхтонкая структура (СТС). Линии СТС от конкретного изотопа имеют приблизительно одинаковую интегральную интенсивность и практически эквидистантны. Если ядро ПЦ имеет несколько изотопов, то каждый изотоп дает свой набор линий СТС. Их количество определяется спином I ядра изотопа, около которого локализован неспаренный электрон. Относительные интенсивности линий СТС от различных изотопов ПЦ пропорциональны естественной распространенности этих изотопов в образце, а расстояние между линиями СТС зависит от величины магнитного момента ядра конкретного изотопа, константы сверхтонкого взаимодействия и степени делокализации неспаренных электронов на этом ядре.
- * Суперсверхтонкая структура (ССТС). Число линий ССТС зависит от числа nл эквивалентных лигандов, с которыми взаимодействует неспаренная спиновая плотность и величины ядерного спина Iл их изотопов. Характерным признаком таких линий также является распределение их интегральных интенсивностей, которое в случае Iл = 1/2 подчиняется закону биномиального распределения с показателем степени nл. Расстояние между линиями ССТС зависит от величины магнитного момента ядер, константы сверхтонкого взаимодействия и степени локализации неспаренных электронов на этих ядрах.
- * спектроскопические характеристики линии.
Особенностью спектров ЭПР является форма их записи. По многим причинам спектр ЭПР записывается не в виде линий поглощения, а как производная от этих линий. Поэтому, в ЭПР-спектроскопии принята несколько иная, отличная от общепринятой, терминология для обозначения параметров линий.
Линия ЭПР поглощения и ее первая производная: 1- гауссова форма; 2- лоренцева форма.
- * Истинная линия - д-функция, но с учетом релаксационных процессов имеет форму Лоренца;
- * Линия - отражает вероятность процесса резонансного поглощения электромагнитного излучения ПЦ и определяется процессами, в которых участвуют спины;
- * Форма линии - отражает закон распределения вероятности резонансных переходов. Поскольку, в первом приближении, отклонения от резонансных условий носят случайный характер, форма линий в магниторазбавленных матрицах имеет гауссову форму. Наличие дополнительно обменных спин-спиновых взаимодействий приводит к лоренцевой форме линии. В общем случае форма линии описывается смешанным законом;
- * Ширина линии - ДВmax - cоответствует расстоянию по полю между экстремумами на кривой линии;
- * Амплитуда линии - Imax - соответствует по шкале амплитуды сигнала расстоянию между экстремумами на кривой линии;
- * Интенсивность - I0 - значение вероятности в точке МАХ на кривой поглощения, вычисляется при интегрировании по контуру линии записи;
- * Интегральная интенсивность - площадь под кривой поглощения, пропорциональна количеству парамагнитных центров в образце и вычисляется путем двойного интегрирования линии записи, сначала по контуру, затем по полю;
- * Положение линии - В0 - соответствует пересечению контура производной dI/dB с нулевой линией (линией тренда);
- * положение линий ЭПР в спектре.
Согласно выражению hн = gвB, определяющему условия резонансного поглощения для ПЦ со спином S = 1/2, положение линии электронного парамагнитного резонанса можно охарактеризовать значением g-фактора (аналог фактора спектроскопического расщепления Ланде). Величина g-фактора определяется как отношение частоты н, на которой проводилось измерение спектра к величине магнитной индукции В0, при которой наблюдался максимум эффекта. Следует отметить, что для парамагнитных центров g-фактор характеризует ПЦ как целое, т.е. не отдельную линию в спектре ЭПР, а всю совокупность линий, обусловленных исследуемым ПЦ.
В ЭПР экспериментах фиксируется энергия электромагнитного кванта, то есть частота н, а магнитное поле В может изменяться в широких пределах. Выделяются некоторые, довольно узкие, диапазоны СВЧ-частот, в которых работают спектрометры.
ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………….2
1.ПРИНЦИП МЕТОДА ЭПР…………………………………………………..3
1.1. История открытия метода ЭПР……………………………………………..3
1.2. Механический и магнитный моменты электрона…………………………4
1.3. Эффект Зеемана…………...............................................................................6
1.4. Основное уравнение резонанса……………………………………………8
2. ХРАКТЕРИСТИКА СПЕКТРОВ ЭПР ………………………………….10
2.1. Амплитуда сигнала, форма линии и ширина линии…………………….10
2.2. Сверхтонкая структура спектров ЭПР………………………………….16
……………………………………………………………..18
3.УСТРОЙСТВО РАДИОСПЕКТРОМЕТРА ЭПР……………………...22
4.ПРИМЕНЕНИЕ ЭПР В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ………………………………………………………….24
4.1.Сигналы ЭПР, наблюдаемые в биологических системах………………..24
4.2. Метод спиновых меток и зондов…………………………………………26
4.3. Метод спиновых ловушек………………………………………………...35
ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………...39
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ………………………..40
ВВЕДЕНИЕ
Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР, электронный спиновый резонанс), явление резонансного поглощения электромагнитного излучения парамагнитными частицами, помещенными в постоянное магнитное поле, обусловленное квантовыми переходами между магнитными подуровнями парамагнитных атомов и ионов (эффект Зеемана). Открыт Завойским Евгением Константиновичем в Казанском государственном университете в 1944 г.
В отсутствие постоянного магнитного поля Н магнитные моменты неспаренных электронов направлены произвольно, состояние системы таких частиц вырождено по энергии. При наложении поля Н проекции магнитных моментов на направление поля принимают определенные значения и вырождение снимается (эффект Зеемана), т. е. происходит расщепление уровня энергии электронов E 0 .
Так как на нижнем уровне число электронов больше в соответствии с распределением Больцмана, то преимущественно будет происходить резонансное поглощение энергии переменного магнитного поля (его магнитной составляющей).
Для непрерывного наблюдения поглощения энергии условия резонанса недостаточно, т.к. при воздействии электромагнитного излучения произойдет выравнивание заселенностей подуровней (эффект насыщения). Для поддержания больцмановского распределения заселенностей подуровней необходимы релаксационные процессы.
Основные параметры спектров ЭПР - интенсивность, форма и ширина резонансной линии , g-фактор, константы тонкой и сверхтонкой (СТС) структуры.
1.ПРИНЦИП МЕТОДА ЭПР
1.1.История открытия метода ЭПР
Метод электронного парамагнитного резонанаса (ЭПР, EPR electron paramagnetic resonance , ESR electron spin resonance ) является основным методом для изучения парамагнитных частиц. К парамагнитным частицам имеющим важное биологическое значение относятся два основных типа это свободные радикалы и комплексы металлов переменной валентности (таких как Fe, Cu, Co, Ni, Mn).
Метод электронного парамагнитного резонанса был открыт в 1944 г. Е.К. Завойским при исследовании взаимодействия электромагнитного излучения микроволнового диапазона с солями металлов. Он заметил, что монокристалл CuCl2, помещенный в постоянное магнитное поле 40 Гаусс (4 мТл), может поглощать излучение с частотой около 133 Мгц.
Пионерами применения ЭПР в биологических исследованиях в СССР были Л.А. Блюменфельд и А.Э. Калмансон, которые начали изучать свободные радикалы белков, полученные под действием ионизирующего излучения.
Со временем, синтез стабильных нитроксильных радикалов существенно расширил область применения метода ЭПР в биологических и медицинских исследованиях. Сегодня этот метод является одним из широко используемых методов современной науки.
1.2. Механический и магнитный моменты электрона
В основе метода ЭПР лежит поглощение электромагнитного излучения радиодиапазона неспаренными электронами, находящимися в магнитном поле.
Хорошо известно, что электрон в атоме участвует в орбитальном и спиновом движении, которые можно охарактеризовать с помощью соответствующих механических и магнитных моментов. Так, орбитальный магнитный момент связан с механическим выражением
(1)
где -магнитный орбитальный момент, а -механический орбитальный момент. В свою очередь механический орбитальный момент может быть выражен через орбитальное квантовое число
(2)
Подставив выражение (1.2) в (1.1) получим, что
Величина является элементарным магнитным моментом и носит название магнетон Бора для электрона. Она обозначается буквой β и равна 9,27·1024 Дж/Тл.
Для спинового магнитного момента можно написать аналогичные выражения
(4)
(5)
(6)
где спиновый магнитный момент, Ps механический магнитный момент, а s спиновое квантовое число. Важно отметить, что коэффициент пропорциональности между и Ps (e/m ) вдвое больше, чем для и Pl (e/2m ).
В итоге полный магнитный момент электрона, являющийся вектором, будет равен сумме векторов орбитального и спинового магнитных моментов
(7)
Поскольку абсолютные значения и могут сильно отличаться, то для удобства учета вклада орбитального и спинового магнитных моментов в суммарный магнитный момент электрона вводят коэффициент пропорциональности, показывающий долю каждого из моментов в полном магнитном моменте величину g или g -фактор.
где Pj полный механический момент электрона, равный Pl + Ps . g -Фактор равен единице при s = 0 (т.е. при отсутствии спинового движения) и равен двум, если орбитальный момент равен нулю (l = 0). g -Фактор идентичен фактору спектроскопического расщепления Ланде и может быть выражен через полные квантовые числа S , P и J :
где (9)
Поскольку в большинстве случаев электронные орбитали сильно отличаются от сферических, то орбитальный магнитный момент дает относительно небольшой вклад в суммарный магнитный момент. Для упрощения вычислений этим вкладом можно пренебречь. Кроме того, если заменить спиновый механический момент его проекцией на выделенное направление (например, на направление магнитного поля), то мы получим следующее выражение:
(10)
где eh/4πm магнетон Бора, а магнитное квантовое число, являющееся проекцией спинового магнитного момента на выделенное направление и равное ±1/2.
1 .3. Эффект Зеемана
Рисунок 1 Ориентация электронов во внешнем магнитном поле (H ).
В отсутствие внешнего магнитного поля магнитные моменты электронов ориентированы случайным образом (рис.1 слева), и их энергия практически не отличается друг от друга (Е0). При наложении внешнего магнитного поля магнитные моменты электронов ориентируются в поле в зависимости от величины спинового магнитного момента (рис.1. справа), и их энергетический уровень расщепляется на два (рис.2).
Рисунок 2 Расщепление энергетических уровней одиночных электронов в магнитном поле (эффект Зеемана).
Энергия взаимодействия магнитного момента электрона с магнитным полем выражается уравнением
(11)
где μ суммарный магнитный момент электрона, Н напряженность магнитного поля, а cos(μH) косинус угла между векторами μ и Н.
В нашем случае энергия взаимодействия электрона с внешним магнитным полем составит величину
(12)
а разница в энергии между двумя уровнями составит
(13)
Таким образом энергетические уровни электронов, помещенных в магнитное поле, расщепляются в этом поле в зависимости от величины спинового магнитного момента и интенсивности магнитного поля (эффект Зеемана ) .
1.4.Основное уравнение резонанса
Количество электронов в изучаемой системе, имеющих ту или иную энергию, будет определяться в соответствии с распределением Больцмана, а именно
(14)
где и количество электронов на более высоком или более низком энергетическом уровне, соответствующем магнитному моменту электрона со спином +1/2 или 1/2.
Если на систему электронов, находящуюся в магнитном поле, падает электромагнитная волна, то при определенных значениях величины энергии падающих квантов будут происходить переходы электронов между уровнями.
Необходимое условие равенство энергии падающего кванта (hν) и разности энергий между уровнями электронов с различными спинами (gβH).
ΔE = hν = gβH (15)
Это уравнение выражает основное условие поглощения энергии электронами и называется основным уравнением резонанса . Под влиянием излучения электроны, находящиеся на более высоком энергетическом уровне, будут испускать энергию и возвращаться на нижний уровень, это явление называется индуцированной эмиссией. Электроны же, находящиеся на нижнем уровне, будут поглощать энергию и переходить на более высокий
энергетический уровень, это явление называется резонансным поглощением . Поскольку вероятности одиночных переходов между энергетическими уровнями равны, а общая вероятность переходов пропорциональна количеству электронов, находящихся на данном энергетическом уровне, то поглощение энергии будет преобладать над ее излучением. Это связано с тем, что как следует из распределения Больцмана заселенность нижнего уровня выше заселенности верхнего энергетического уровня.
Следует помнить, что различие в уровнях энергии электрона в магнитном поле (а также и других заряженных частиц, обладающих спином, например, у протонов) связано с наличием у электрона собственного магнитного момента. У спаренных электронов магнитные моменты скомпенсированы, и они на внешнее магнитное поле не реагируют, поэтому обычные молекулы не дают сигналов ЭПР. Таким образом, ЭПР позволяет обнаруживать и изучать свойства свободных радикалов (имеющих неспаренный электрон на внешних орбиталях) и комплексов металлов переменной валентности (у которых неспаренный электрон принадлежит более глубоким электронным оболочкам). Эти две группы парамагнитных частиц часто называют парамагнитными центрами.
2.ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕКТРОВ ЭПР
Метод ЭПР позволяет нам изучать свойства парамагнитных центров посредством спектров поглощения электромагнитного излучения этими частицами. Зная характеристики спектров можно судить и о свойствах парамагнитных частиц. К основным характеристикам спектров относятся амплитуда, ширина линии, форма линии, g -фактор и сверхтонкая структура спектров.
2.1. Амплитуда сигнала, форма линии и ширина линии
Амплитуда сигнала
Сигнал ЭПР представляет собой первую производную от спектра поглощения (рис. 3). Площадь под линией поглощения пропорциональна концентрации парамагнитных частиц в образце. Таким образом, концентрация парамагнитных центров пропорциональна первому интегралу под линией поглощения или второму интегралу от спектра ЭПР. Если два сигнала имеют одинаковую ширину, то концентрации парамагнитных центров соотносятся как амплитуды сигналов в спектрах поглощения.
Рисунок 3 - Сигнал ЭПР. Слева зависимость поглощения СВЧ от напряженности магнитного поля (H); справа первая производная этой зависимости. ЭПР-спектрометры регистрируют кривые второго типа.
Для определения концентрации измеряют площади под кривой поглощения у образца сравнения с известной концентрацией парамагнитных центров и у измеряемого образца и неизвестную концентрацию находят из пропорции, при условии, что оба образца имеют одинаковый объем:
(16)
где и концентрации измеряемого образца и образца сравнения соответственно, а S x и S 0 площади под линиями поглощения измеряемого сигнала и образца сравнения.
Для определения площади под линией поглощения неизвестного сигнала можно воспользоваться приемом численного интегрирования
(17)
где f "(H ) первая производная линии поглощения (спектр ЭПР), F (H ) функция линии поглощения, а H напряженность магнитного поля.
(18)
Учитывая, что F (H ) . H в точках -∞ и ∞ равно нулю и dF (H ) равно f "(H ) dH , получим
(19)
где f "(H ) первая производная от линии поглощения, или спектр ЭПР. От интеграла легко перейти к интегральной сумме, учитывая, что H = nΔH , получим
(20)
где Δ H шаг изменения магнитного поля, а n i номер шага. Таким образом, площадь под кривой поглощения будет равна произведению квадрата величины шага магнитного поля на сумму произведений амплитуды спектра ЭПР на номер шага. Из выражения (20) легко видеть, что при больших n (т.е. вдали от центра сигнала) вклад удаленных частей спектра может быть достаточно большим даже при малых значениях амплитуды сигнала.
Форма линии
Хотя согласно основному уравнению резонанса поглощение происходит только при равенстве энергии падающего кванта разности энергии между уровнями неспаренных электронов, спектр ЭПР является непрерывным в некоторой окрестности точки резонанса. Функция, описывающая сигнал ЭПР называется функцией формы линии. В разбавленных растворах, когда можно пренебречь взаимодействием между парамагнитными частицами, кривая поглощения описывается функцией Лоренца:
(21)
где функция кривой поглощения в точке резонанса, значение поля в точке резонанса, ширина сигнала на половине высоты. Аналогичные обозначения используются для кривой поглощения, описываемой функцией Гаусса.
(22)
Функция Гаусса является огибающей спектра ЭПР если между парамагнитными частицами существует взаимодействие. Учитывать форму линии особенно важно при определении площади под кривой поглощения. Как видно из вышеприведенных формул у Лоренцевой линии более медленное убывание и соответственно более широкие крылья, что может давать значительную ошибку при интегрировании спектра.
Ширина линии
Ширина спектра ЭПР зависит от взаимодействия магнитного момента электрона с магнитными моментами окружающих ядер (решетки) (спин-решеточное взаимодействие) и электронов (спин-спиновое взаимодействие). В отсутствие этих взаимодействий энергия, поглощенная электронами, приводила бы к снижению разности заселенности уровней и прекращению поглощения.
Однако, в эксперименте изменения разности заселенности уровней не наблюдается благодаря тому, что существуют процессы, в которых поглощенная энергия передается окружению и электроны возвращаются на исходный уровень. Такие процессы называются процессами релаксации, они поддерживают постоянной разность заселенности энергетических уровней. Механизм релаксации заключается в передаче электромагнитной энергии кванта решетке или окружающим электронам и возвращении электрона на
низкоэнергетический уровень. Время, в течение которого электрон пребывает на высокоэнергетическом уровне, называется временем релаксации. Соответственно существует время спин-решеточной (Т 1) и спин-спиновой (Т 2) релаксации.
Одна из причин уширения полос поглощения в сигналах ЭПР кроется в волновых свойствах элементарных частиц, которые проявляются в существовании известного принципа соотношения неопределенностей Гейзенберга. Согласно этому принципу, чем точнее задано время наблюдения (чем меньше Δ t ), тем больше неопределенность в величине энергии частицы (:
(23)
Если принять, что Δ t это время релаксации T , а Δ Е соответствует g βΔ H , то мы получим, что
(24)
т.е. неопределенность в ширине линии обратно пропорциональна времени релаксации. Наблюдаемое время релаксации считают суммой времени спин-решеточной и спин-спиновой релаксации.
(25)
Свободные радикалы в растворах имеют Т1>> T 2, следовательно ширина линии будет зависеть в основном от Т2.
«Естественное» уширение сигнала ЭПР, зависящее от времени спин-решеточной и спин-спиновой релаксации не единственный механизмам, влияющий на ширину линии c игнала. Важную роль играют также диполь-дипольное взаимодействие ; анизотропия g -фактора; динамическое уширение линии и спиновый обмен.
В основе диполь-дипольного взаимодействия лежит взаимодействие магнитного момента неспаренного электрона с локальным магнитным полем, создаваемым соседними электронами и ядрами. Напряженность магнитного поля в точке, где находится неспаренный электрон, зависит от взаимной ориентации магнитных моментов неспаренного электрона и другого электрона или ядра и расстояния между этими центрами. Изменение энергии неспаренного электрона определяется уравнением
(26)
где μ магнитный момент электрона, θ угол между взаимодействующими магнитными моментам R расстояние между ними.
Вклад анизотропии g-фактора в уширение линии ЭПР связан с тем, что орбитальное движение электрона создает магнитное поле, с которым взаимодействует спиновый магнитный момент. Это создает сдвиг величины напряженности внешнего поля, при которой наблюдается резонанс, т.е. к сдвигу положения максимума сигнала ЭПР. В свою очередь, это проявляется в кажущемся отклонении g -фактора свободного электрона от значения 2,00. С другой стороны, влияние орбитального магнитного поля на электрон
зависит от ориентации молекулы по отношению к внешнему магнитному полю, что приводит к уширению сигнала ЭПР при измерении в системе, состоящей из множества хаотически ориентированных молекул.
Уширение сигнала ЭПР может быть связано также с взаимным превращением двух парамагнитных частиц. Так, если каждая из частиц имеет свой спектр ЭПР, то увеличение скорости взаимного превращения друг в друга будет приводить к уширению линий, т.к. при этом уменьшается время жизни радикала в каждом состоянии. Такое изменение ширины сигнала называется динамическим уширением сигнала.
Спиновый обмен является еще одной из причин уширения сигнала ЭПР. Механизм уширения сигнала при спиновом обмене заключается в изменении направления спинового магнитного момента электрона на противоположное при соударении с другим неспаренным электроном или иным парамагнетиком. Поскольку при таком соударении уменьшается время жизни электрона в данном состоянии, то опять-таки сигнал ЭПР уширяется. Наиболее частым случаем уширения линии ЭПР по механизму спинового обмена является уширение сигнала в присутствие кислорода или парамагнитных ионов металлов .
2.2 Сверхтонкая структура спектров ЭПР
В основе расщепления одиночной линии ЭПР на несколько лежит явление сверхтонкого взаимодействия , т. е. взаимодействия магнитных моментов неспаренных электронов () с магнитными моментами соседних ядер (
На рисунке 4 дано пояснение сверхтонкого взаимодействия. Неспаренный электрон в радикале может быть расположен близко к протону, например как в радикале этанола (1). В отсутствие влияния близлежащих протонов электрон имеет сигнал в форме одиночной линии (2). Однако протон также имеет магнитный момент, который ориентирован во внешнем магнитном поле (H 0) в двух направлениях (по полю либо против поля) потому, что, подобно электрону, имеет спиновое число S = ½. Будучи маленьким магнитом, протон создает магнитное поле, которое в месте расположения электрона имеет определенные значения +Hp или Hp в зависимости от ориентации протона (3). В результате суммарное магнитное поле, приложенное к неспаренному электрону (4), имеет значение, немного большее (+ Hp) или немного меньшее ( Hp), чем в отсутствии протона (). Поэтому сигнал ЭПР радикала состоит из двух полос, расстояние от которых до прежнего центра полосы равно Hp (5).
Рисунок 4- Сверхтонкое расщепление сигнала ЭПР в радикале этанола.
1 радикал этанола. 2 сигнал ЭПР электрона во внешнем поле. 3 ориентация протонов во внешнем магнитном поле. 4 увеличение или уменьшение поля, действующего на электрон в результате наложения магнитного поля протона (H p) на внешнее магнитное поле. 5 сигнал ЭПР радикала, в котором магнитное поле протона накладывается на внешнее магнитное поле.
В рассмотренном нами примере спин ядра, взаимодействующего с неспаренным электроном, был равен ± 1/2, что в конечном итоге дало нам расщепление на две линии. Такая величина спина характерна для протонов. У ядер атомов азота (N14) спин целочисленный . Он может принимать значения ±1 и 0. В этом случае при взаимодействии неспаренного электрона с ядром атома азота будет наблюдаться расщепление на три одинаковых линии, соответствующих величине спина +1, 1 и 0. В общем случае число
линий в спектре ЭПР равно 2 m N+1. (см. далее, рис.10)
Естественно, что количество неспаренных электронов и соответственно площадь под кривой поглощения ЭПР не зависят от величины спина ядра и являются постоянными величинами. Следовательно, при расщеплении одиночного сигнала ЭПР на два или три, интенсивность каждой компоненты будет соответственно в 2 или 3 раза ниже.
Очень похожая картина возникает, если неспаренный электрон взаимодействует не с одним, а с несколькими эквивалентными (с одинаковой константой сверхтонкого взаимодействия) ядрами, имеющими магнитный момент отличный от нуля, например двумя протонами. В этом случае возникает три состояния, соответствующие ориентации спинов протонов: (а) оба по полю, (б) оба против поля и (в) один по полю и один против поля. Вариант (в) имеет вдвое большую вероятность, чем (а) или (б), т.к. может быть осуществлен двумя способами. В результате такого распределения неспаренных электронов одиночная линия расщепится на три с соотношением интенсивностей 1:2:1. В общем случае, для n эквивалентных ядер со спином mN число линий равно n 2 m N +1.
2.3. Свойства атомов с магнитными ядрами, константы, СТВ неспаренного электрона с ядром
|
Атом |
Массовое число |
Ядерный спин |
а x 10- 4 Тл |
|
|
99,98 |
||||
|
7,52 |
54,29 |
|||
|
92,48 |
143,37 |
|||
|
316,11 |
||||
|
93,26 |
82,38 |
|||
|
72,15 |
361,07 |
|||
|
27,85 |
1219,25 |
|||
|
819,84 |
В -электронных системах (большинство органических свободных радикалов) спиновая плотность в точке ядра равна нулю (узловая точка р-орбитали) и реализуются два механизма возникновения СТВ (спинового переноса): конфигурационное взаимодействие и эффект сверхсопряжения. Механизм конфигурационного взаимодействия иллюстрируется рассмотрением СН-фрагмента (рис. 5). Когда на р-орбитали появляется неспаренный электрон , его магнитное поле взаимодействует с парой электронов -связи С Н так, что происходит их частичное распаривание (спиновая поляризация), в результате чего на протоне появляется отрицательная спиновая плотность , поскольку энергии взаимодействия спинов и различны. Состояние, указанное на рис. 5, а, более устойчиво, так как для углеродного атома , несущего неспаренный электрон , в соответствии с правилом Хунда реализуется максимальная мультиплетность . Для систем этого типа существует связь между константой СТВ с протоном и спиновой плотностью на соответствующем углеродном атоме , определяемая соотношением Мак-Коннела: где Q = -28 x 10 -4 Тл, - спиновая плотность на атоме углерода . Спиновый перенос по механизму конфигурационного взаимодействия реализуется для ароматических протонов и -протонов в органических свободных радикалах.
Рисунок 5 - Возможные спиновые конфигурации для -орбитали, связывающей атом водорода во фрагменте С Н, и р-орбитали атома углерода со спином а - спины на связывающей -орбитали и р-орбитали атома углерода параллельны, б - те же спины антипараллельны.
Эффект сверхсопряжения заключается в непосредственном перекрывании орбиталей неспаренного электрона и магнитных ядер. В частности, в алкильных радикалах СТВ по этому механизму возникает на ядрах -протонов. Например, в этильном радикале на -протонах СТВ определяется конфигурационным взаимодействием, а на -протонах - сверхсопряжением. Эквивалентность СТВ с тремя протонами метильной группы в рассматриваемом случае обусловлена быстрым вращением группы СН 3 относительно связи С С. В отсутствие свободного вращения (или в случае затрудненного вращения), что реализуется в жидкой фазе для множества систем с разветвленными алкильными заместителями или в монокристаллических образцах, константа СТВ с -протонами определяется выражением , где - двугранный угол между 2р z -орбиталью -углеродного атома и связью СН, В 0 4 x 10 -4 Тл определяет вклад спиновой поляризации по ядерному остову (конфигурационное взаимодействие), B 2 45 x 10 -4 Тл. В пределе быстрого вращения а н = 2,65 x 10- 3 Тл. В спектроскопии ЭПР триплетных состояний (S=1) помимо электрон-ядерных взаимодействий (СТВ) необходимо учитывать взаимодействие неспаренных электронов друг с другом. Оно определяется диполь-дипольным взаимодействием, усредняемым до нуля в жидкой фазе и описываемым параметрами нулевого расщепления D и E, зависящими от расстояния между неспасенными электронами (радикальные пары), а также обменным взаимодействием (изотропным), обусловленным непосредственным перекрыванием орбиталей неспаренных электронов (спиновый обмен), которое описывается обменным интегралом J обм . Для бирадикалов , в которых каждый из радикальных центров имеет одно магнитное ядро с константой СТВ на этом ядре а, в случае быстрого (сильного) обмена J обм а, и каждый неспаренный электрон бирадикальной системы взаимодействует с магнитными ядрами обоих радикальных центров. При слабом обмене (J обм а) регистрируются спектры ЭПР каждого радикального центра независимо, то есть фиксируется "монорадикальная" картина. Зависимость J обм от т-ры и растворителя позволяет получить динамические характеристики бирадикальной системы (частоту и энергетический барьер спинового обмена) .
- УСТРОЙСТВО РАДИОСПЕКТРОМЕТРА ЭПР
Устройство радиоспектрометра ЭПР лишь весьма отдаленно напоминает устройство спектрофотометра для измерения оптического поглощения в видимой и ультрафиолетовой частях спектра (рис. 6).
Рисунок 6 Устройство ЭПР спектрометра.
Источником излучения в радиоспектрометре является клистрон, представляющий из себя радиолампу, дающую монохроматическое излучение в диапазоне сантиметровых волн.
Роль диафрагмы в радиоспектрометре выполняет аттенюатор, позволяющий дозировать мощность, падающую на образец. Кювета с образцом в радиоспектрометре находится в специальном блоке, называемом резонатором. Резонатор представляет собой изготовленный из металла полый параллелепипед, полость которого имеет цилиндрическую или прямоугольную форму. В ней находится поглощающий образец. Размеры резонатора таковы, что входящее излучение образует в нем стоячую электромагнитную волну. Элементом, полностью отсутствующим в оптическом спектрометре, является электромагнит, создающий постоянное магнитное поле, необходимое для расщепления энергетических уровней электронов. Излучение, прошедшее измеряемый образец, попадает на детектор, затем сигнал детектора усиливается и регистрируется на самописце или компьютере. Своеобразие конструкции радиоспектрометра заключается в том, что излучение радиодиапазона передается от источника к образцу и далее к детектору с помощью специальных трубок прямоугольного сечения, служащих волноводами. Размеры сечения волноводов определяются длиной волны передаваемого излучения. Эта особенность передачи радиоизлучения по волноводам и определяет тот факт, что для регистрации спектра ЭПР в радиоспектрометре используется постоянная частота излучения, а условие резонанса достигается изменением величины магнитного поля.
Еще одной важной особенностью радиоспектрометра является то, что этот прибор измеряет не поглощение (A) электромагнитных (свч) волн, а первую производную поглощения по напряженности магнитного поля dA/dH. Дело в том, что для измерения поглощения нужно сравнивать интенсивности прошедшего излучения у измеряемого и контрольного объекта (скажем, пустой кюветы), а при измерении первой производной контрольный объект не нужен. При изменении магнитного поля интенсивность свч волн, прошедших через пустое пространство или непоглощающий объект, не изменяется и первая производная поглощения равна нулю. Если же свч волны проходят через объект с парамагнитными центрами, то поглощение имеет место, а его величина зависит от напряженности магнитного поля. Изменяем поле и изменяется поглощение, что проявляется в изменении интенсивности измеряемого свч колебания. Именно это изменение интенсивности измеряемого свч при небольшой модуляции магнитного поля около заданной его величины позволяет определять dA/dH в каждой точке H, получая тем самым спектры, или сигналы ЭПР .
- ПРИМЕНЕНИЕ ЭПР В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
- Сигналы ЭПР, наблюдаемые в биологических системах
Применение метода ЭПР в биологических исследованиях связано с изучением двух основных видов парамагнитных центров свободных радикалов и ионов металлов переменной валентности. Изучение свободных радикалов в биологических системах связано с трудностью, заключающейся в низкой концентрации свободных радикалов, образующихся при жизнедеятельности клеток. Концентрация радикалов в нормально метаболизирующих клетках составляет по разным источникам примерно М, в то время как современные радиоспектрометры позволяют измерять концентрации радикалов М. Повысить концентрацию свободных радикалов можно затормозив их гибель или повысив скорость их образования. В условиях эксперимента образование
радикалов легче всего наблюдать при облучении биологических объектов при очень низкой температуре (скажем 77К) в ходе их облучения УФ или ионизирующей радиацией. Изучение структуры радикалов более или менее сложных биологически важных молекул, полученных в таких условиях, и было одним из первых направлений применения метода ЭПР в биологических исследованиях (рис.7). Вторым направлением применения метода ЭПР в биологических исследованиях было изучение металлов переменной валентности и/или их комплексов, существующих in vivo . Из-за коротких времен релаксации сигналы ЭПР металлопротеинов тоже можно наблюдать только при низкой температуре, например, температуре жидкого азота или даже гелия.
Рисунок 7 - Спектры ЭПР УФ-облученного цистеина при температуре жидкого азота (77 К) и обычной температуре (300 К).
В качестве примера на рис. 8 дан спектр ЭПР печени крысы. На нем можно увидеть сигналы цитохрома Р-450, имеющие g -фактор 1,94 и 2,25, сигнал метгемоглобина с g - фактором 4,3 и сигнал свободных радикалов, принадлежащий семихинонным радикалам аскорбиновой кислоты и флавинов с g -фактором 2,00.
Рисунок 8 - Спектр ЭПР печени крысы.
Впрочем, сигналы ЭПР некоторых радикалов можно наблюдать и при комнатной температуре. К таким сигналам относятся сигналы ЭПР многих семихинонных или феноксильных радикалов, таких как семихинонный радикал убихинона, феноксильный и семихинонный радикал α-токоферола (витамина Е), витамина D, и многие другие (рис.9).
Рисунок 9 - Сигналы ЭПР семихинонных и феноксильных радикалов.
- Метод спиновых меток и зондов
Важным этапом в развитии применения метода ЭПР в биологических исследованиях стал синтез стабильных свободных радикалов. Среди таких радикалов наибольшую популярность получили нитроксильные радикалы.
Стабильность нитроксильных радикалов обусловлена пространственным экранированием группы NO . , имеющей неспаренный электрон, четырьмя метильными группами, препятствующими протеканию реакции с участием свободной валентности. Однако, такая экранировка не является абсолютной и реакция восстановления свободной валентности все-таки может происходить. Аскорбиновая кислота, например, является хорошим восстановителем нитроксильных радикалов.
Спектр ЭПР нитроксильных радикалов обычно состоит из трех линий равной интенсивности, благодаря взаимодействию неспаренного электрона с ядром атома азота (рис.10).
Рисунок 10 - Формула и спектр ЭПР нитроксильного радикала 2,2,6,6-
тетраметил-пиперидин-1-оксил (ТЕМПО).
Оставим в стороне непростую теорию, объясняющую зависимость формы сигнала ЭПР от подвижности зонда и ограничимся весьма схематическим изложением того, что наблюдается в опытах. Если нитроксильный радикал находится в водном растворе, то его вращение является изотропным и достаточно быстрым, при этом наблюдается сигнал ЭПР, состоящий из трех узких симметричных линий (рис. 11, вверху). При уменьшении скорости вращения наблюдается уширение линий и изменению амплитуды компонент спектра (рис. 11, в середине). Дальнейшее увеличение вязкости среды приводит к еще большему изменению сигнала ЭПР спинового зонда (рис. 11, внизу).
Для количественного описания вращательного движения радикала используют понятие времени вращательной корреляции (τс). Оно равно времени поворота нитроксильного радикала на угол π/2. На основании анализа сигнала ЭПР время корреляции можно оценить, используя эмпирическое уравнение
(27)
Где Δ ширина полосы спектра ЭПР при низком значении поля, а и интенсивность высокопольной и низкопольной компоненты спектра ЭПР. Это уравнение можно использовать при времени корреляции от 5·до с.
Синтез стабильных нитроксильных радикалов семейства ТЕМПО был важным этапом в использовании метода ЭПР для изучения внутренней вязкости биологических мембран и белков решению медико-биологических задач.
Рисунок 11 - Спектр ЭПР ТЕМПО при разных временах вращательной корреляции τс (цифры слева от спектров ).
Однако производные ТЕМПО, имеют, к сожалению, один существенный недостаток - вследствие их амфифильности трудно бывает определить локализацию этого зонда и таким образом ответить на вопрос, где мы, собственно говоря, определяем микровязкость. Эта проблема была практически решена, когда появились так называемые «жирнокислотные спиновые зонды», т.е. соединения, в которых молекула нитроксильного радикала была ковалентно присоединена к молекуле жирной кислоты. В этом случае спектр ЭПР несомненно отражает свойства именно гидрофобной (липидной) фазы изучаемой системы, куда встаивается зонд. На рисунке 12 приведено схематическое строение молекулы жирнокислотного спинового зонда, 5-доксилстеарата, в которой нитроксильный радикал (доксил, соединение родственное ТЕМПО по структуре) присоединен к 5 атому углерода молекулы стеариновой кислоты. Характеристикой движения такого зонда служит величина, называемая параметром упорядоченности S , который характеризует степень асимметрии вращания зонда относительно продольной и поперечной осей его молекулы. Найти параметр упорядоченности можно из характеристик спектра ЭПР по эмпирическому уравнению
(28)
где A|| и A ⊥ параметры, указанные на рисунке. Теоретически, параметр упорядоченности может изменяться от 0 до 1, с изменением вязкости и структурированности мембраны. При совершенно симметричном вращении, когда скорость вращения вокруг трех осей одинакова (что характерно для сферических частиц в изотропной среде), параметр упорядоченности равен нулю. Параметр упорядоченности равен 1, если ось вращения зонда совпадает с нормалью к мембране, а вращение относительно иных осей полностью отсутствует. При низких температурах или в мембранах из синтетических насыщенных фосфолипидов, вращение зонд вращается преимущественнол вокруг длинной оси молекулы, ориетированной поперек мембраны. При этом параметр упорядоченности имеет высокие значсения. При уменьшении вязкости мембраны значение параметра упорядоченности уменьшается.
Рисунок 12 Химическая формула и спектр ЭПР 5 доксилстеарата.
Очень ценным качеством спиновых зондов, содержащих жирную кислоту, является возможность измерения с их помощью параметра упорядоченности на разном расстоянии от поверхности мембраны, так называемого профиля упорядоченности или профиля вязкости. Для этого используют набор спиновых зондов, которые представляют собой молекулы одной и той же жирной кислоты, которые содержат нитроксильный фрагмент на разном расстоянии от карбоксильной группы. Например, используются спиновые зонды с нитроксильным радикалом у 5, 7, 12 и 16 атома углерода стеариновой кислоты. Набор этих соединений позволяет измерять параметр S на расстоянии 3,5, 5, 8,5 и 10,5 ангстрем от поверхности мембраны (рис.13).
Рисунок 13- Изменение сигнала ЭПР при удалении нитроксильного радикала от полярной карбоксильной группы жирной кислоты.
Обычно спектры ЭПР спинового зонда, включенного в мембрану, и зонда, находящегося в окружающем водном растворе, могут существенно различаться. Это свойство было использовано для создания нового класса спиновых зондов, позволяющих измерять межфазный потенциал мембраны (часто называемый поверхностным потенциалом). Для измерения этого потенциала измеряют коэффициент распределения вода/мембрана нейтрального и заряженного зондов. Поскольку заряженный зонд взаимодействует с зарядами, расположенными на поверхности мембраны, то его коэффициент распределения будет отличаться от такового у нейтрального зонда. Отношение коэффициентов распределения служит мерой поверхностного потенциала изучаемой мембраны. Химическая формула спинового зонда, используемого для измерения поверхностного потенциала приведена на рис.14 .
Рисунок 14 - Химическая формула заряженного спинового зонда.
Еще одним важным применением метода спинового зонда является измерение рН в микрообъемах, например, внутри лизосом или фагосом клеток. Для этих целей применяют специальные рН-чувствительные спиновые зонды (рис. 15). В основе метода рН-метрии с применением спиновых зондов лежит способность зонда давать разные спектры ЭПР в
протонированной и депротонированной формах. Таким образом, в зависимости от рК спинового зонда, существует некоторый диапазон рН в котором и происходит его протонирование и соответствующее изменение спектра ЭПР (рис.16).
Рисунок 15 - Химические формулы рН-чувствительного спинового зонда.
Рисунок 16 - Спектры ЭПР и и зависимость концентрации депротонированного рН- чувствительного спинового зонда от рН
Все о чем до сих пор говорилось в данном разделе касалось метода спиновых зондов . Однако не менее интересным является и метод спиновых меток . В основе метода спиновых меток лежит тот же принцип изменения спектра ЭПР нитроксильного радикала в зависимости от скорости и изотропности его вращения. Отличием же метода является тот факт, что спиновая метка ковалентно связывается с другой более или менее крупной
молекулой.
Одним из первых и удачных применений метода спиновой метки было измерение количества и доступности SH-групп белков (рис.17). Химическая формула и спектр ЭПР спиновой метки, взаимодействующей с сульфгидрильными группами, в свободном состоянии и после присоединения к белку приведены на рис.18.
Рисунок 17 - Схема взаимодействия спинового зонда с тиоловой группой белка.
Из рисунка можно видеть, что спектры ЭПР спиновой метки в свободном и связанном состоянии сильно отличаются, что связано с различием в скорости и направлении вращения. Естественно, что связанная спиновая метка имеет значительно более низкую скорость вращения, чем в свободном виде. Более того, количество связанных спиновых меток и соответственно интенсивность сигнала ЭПР пропорциональны количеству
прореагировавших со спиновой меткой сульфгидрильных групп, что позволяет определять не только подвижность зонда, но и его количество.
Рисунок 18 - Химическая формула спиновой метки для SH-групп и спектры ЭПР иммобилизованной (1), связанной (2) и свободной (3) спиновой метки.
В настоящее время существует множество методических приемов, позволяющих изучать топографию белковой глобулы с использованием спиновых меток. Поскольку многие ионы металлов переменной валентности являются парамагнетиками и кроме того могут находиться в активном центре фермента, то взаимодействие спиновой метки, прикрепленной, например, к остатку цистеина или гистидина белковой глобулы, с ионом металла будет приводить к уширению спектра ЭПР в результате диполь-дипольного взаимодействия парамагнетиков .
- Метод спиновых ловушек
Появление нитроксильных радикалов оказалось решающим событием в решении проблемы обнаружения и исследования свободных радикалов, образующихся в живых системах. Обнаружение радикалов оказалось возможным благодаря появлению метода
спиновых ловушек. Суть метода заключается в том, что некоторое соединение, не являющееся нитроксильным радикалом, но имеющее структуру близкую к нитроксильному радикалу (спиновая ловушка ), взаимодействует со свободным, короткоживущим радикалом и превращается в долгоживущий нитроксильный радикал (спиновый аддукт ), спектр ЭПР которого, уникален для данного радикала или семейства радикалов.
По химической природе спиновые ловушки можно отнести к двум основным классам это нитроны и нитрозосоединения. К нитронам относятся две наиболее популярные спиновые ловушки С-фенил-N-трет-бутил нитрон (ФБН) и 5,5-диметил-пирролин-1- оксил (ДМПО). Реакция взаимодействия ФБН с радикалом выглядит следующим образом:
Стабильность образующегося нитроксильного радикала ФБН (спинового аддукта ) объясняется тем, что атом кислорода, на котором локализован неспаренный электрон, пространственно экранирован тремя метильными группами. Спиновый аддукт радикала обладает уникальным спектром ЭПР (см. рис.19). При этом форма спектров ЭПР спиновых аддуктов зависит от природы присоединившегося свободного радикала. Таким образом удается проводить исследование свободнорадикальных реакций в биологических объектах методом ЭПР при физиологических температурах.
Рисунок 19 - Спектр ЭПР спинового аддукта и значения констант сверхтонкого расщепления для некоторых радикалов.
aH и aN константы сверхтонкого расщепления на протоне и атоме азота соответственно
Рисунок 20 Схема реакции ловушки ДМПО и ОН радикала.
На рис. 20 показана реакция другой спиновой ловушки, ДМПО с гидроксильным радикалом и образование спинового аддукта этого радикала. Опять-таки, измеряя константы сверхтонкого расщепления спектра спинового аддукта можно идентифицировать короткоживущий радикал .
Метод спиновых ловушек занимает одно из важнейших мест в медико-биологических исследованиях, т.к. позволяет обнаруживать и идентифицировать радикалы, образующиеся в живых клетках и тканях. Среди таких радикалов следует отметить супероксидный и гидроксильный радикалы, а также оксид азота. Кроме того, применение метода спиновых ловушек дает возможность иучать антиоксидантные свойства веществ и величину антиоксидантного резерва .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) основан на взаимодействии вещества с магнитным полем. Как следует из названия метода, он применяется для исследования парамагнитных частиц.
Известно, что при помещении парамагнетиков в магнитное поле, парамагнетик втягивается в это поле. Это связано с наличием у парамагнетиков магнитных моментов.Магнитные моменты создаются неспаренными электронами.
Примерами парамагнитных частиц, представляющих интерес для биологов, служат свободные радикалы, являющиеся промежуточными продуктами биохимических реакций, ионы металлов переменной валентности, таких как железо, медь, марганец и др.
Проявление магнитного момента у электрона связано с тем, что электрон является заряженной частицей, и при вращении электрона вокруг своей оси (спиновое движение) возникает магнитное поле, направленное вдоль оси вращения. При помещении парамагнитного образца в магнитное поле магнитные моменты неспаренных электронов ориентируются в этом
поле, подобно тому, как это происходит с магнитными стрелками.
Магнитный момент неспаренного электрона во внешнем магнитном поле может ориентироваться двумя способами - по полю и против поля. Таким образом, если в исследуемой системе имеются неспаренные электроны, наложение внешнего магнитного поля приводит к разделению электронов по группам: магнитные моменты одних электронов ориентированы по полю, других против.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
- Д. Ингрэм Электронный парамагнитный резонанс в биологии [Текст]. Изд-во «Мир», 1972.
- Свободные радикалы в биологических системах [Текст]. т.1, ст.88-175, 178-226. Изд-во «Мир», 1979.
3. Дж. Вертц и Дж. Болтон, Теория и практические приложения метода ЭПР [Текст], Москва: Мир,1975.
4. Современные методы биофизических исследований [Текст]. Практикум по биофизике, под редакцией А.Б. Рубина, Москва: Высшая школа, 1988.
5. Метод спиновых меток [Текст]. Теория и применение, под редакцией Л. Берлинера, Москва: Мир, 1979.
6. А.Н. Кузнецов, Метод спинового зонда, Москва [Текст]: Наука, 1976.
7. В.Е. Зубарев, Метод спиновых ловушек, Москва [Текст]: Издательство МГУ, 1984.
PAGE \* MERGEFORMAT 1
Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) - явление резонансного поглощения электромагнитного излучения парамагнитным веществом, помещенным в постоянное магнитное поле. Обусловлен квантовыми переходами между магнитными подуровнями парамагнитных атомов и ионов (эффект Зеемана). Спектры ЭПР наблюдаются, главным образом, в диапазоне сверхвысоких частот (СВЧ).
Метод электронного парамагнитного резонанса позволяет оценить эффекты, проявляющиеся в спектрах ЭПР из-за наличия локальных магнитных полей. В свою очередь локальные магнитные поля отражают картину магнитных взаимодействий в исследуемой системе. Таким образом, метод ЭПР спектроскопии позволяет исследовать как структуру парамагнитных частиц, так и взаимодействие парамагнитных частиц с окружением.
ЭПР спектрометр предназначен для регистрации спектров и измерения параметров спектров образцов парамагнитных веществ в жидкой, твердой или порошкообразной фазе. Он используется при реализации существующих и разработке новых методик исследований веществ методом ЭПР в различных областях науки, техники и здравоохранения: например, для исследования функциональных характеристик биологических жидкостей по спектрам введенных в них спиновых зондов в медицине; для обнаружения радикалов и определения их концентрации; в исследовании внутримолекулярной подвижности в материалах; в сельском хозяйстве; в геологии .
Базовым устройством анализатора является спектрометрический блок - спектрометр электронного парамагнитного резонанса (ЭПР спектрометр).
Анализатор обеспечивает возможность исследования образцов:
- с регуляторами температур - системами термостатирования образца (в том числе, в диапазоне температур от -188 до +50 ºС и при температуре жидкого азота);
- в кюветах, ампулах, капиллярах и трубках с использованием систем автоматической смены и дозирования образцов.
Особенности работы ЭПР спектрометра
Парамагнитный образец в специальной кювете (ампуле или капилляре) помещается внутрь рабочего резонатора, расположенного между полюсами электромагнита спектрометра. Электромагнитное СВЧ излучение постоянной частоты поступает в резонатор. Условие резонанса достигается путем линейного изменения напряженности магнитного поля. Для повышения чувствительности и разрешающей способности анализатора используется высокочастотная модуляция магнитного поля.
Когда индукция магнитного поля достигает величины, характерной для данного образца, происходит резонансное поглощение энергии этих колебаний. Преобразованное излучение далее поступает на детектор. После детектирования сигнал обрабатывается и подается на регистрирующее устройство. Высокочастотная модуляция и фазочувствительное детектирование преобразуют сигнал ЭПР в первую производную кривой поглощения, в виде которой и происходит регистрация спектров электронного парамагнитного резонанса. В этих условиях регистрируется и интегральная линия поглощения ЭПР. Пример регистрируемого спектра резонансного поглощения представлен на рисунке ниже.
ЭЛЕКТРОННЫЙ ПАРАМАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС (ЭПР, электронный спиновый резонанс), явление резонансного поглощения электромагн. излучения парамагн. частицами, помещенными в постоянное магн. поле; один из методов радиоспектроскопии . Используется для изучения систем с ненулевым электронным спиновым магн. моментом (т. е. обладающих одним или неск. неспаренными электронами ): атомов , своб. радикалов в газовой, жидкой и твердой фазах, точечных дефектов в твердых телах , систем в триплетном состоянии, ионов переходных металлов .
Физика явления. В отсутствие постоянного магн. поля Н магн. моменты неспаренных электронов направлены произвольно, состояние системы таких частиц вырождено по энергии. При наложении поля Н проекции магн. моментов на направление поля принимают определенные значения и вырождение снимается (см. Зеемана эффект ), т. е. происходит расщепление уровня энергии электронов E 0 . Расстояние между возникшими подуровнями зависит от напряженности поля Н и равно (рис. 1), где g - фактор спектроскопич. расщепления (см. ниже), - магнетон Бора , равный 9,274 x 10 -24 Дж/Тл; в системе единиц СИ вместо Н следует использовать магн. индукцию где - магн. проницаемость своб. пространства, равная 1,257 x 10 -6 Гн/м. Распределение электронов по подуровням подчиняется закону Больцмана, согласно к-рому отношение заселенностей подуровней определяется выражением где k - постоянная Больцмана , Т - абс. т-ра. Если на образец подействовать переменным магн. полем с частотой v, такой, что (h - постоянная Планка ), и направленным перпендикулярно H, то индуцируются переходы между соседними подуровнями, причем переходы с поглощением и испусканием кванта hv равновероятны. Т.к. на нижнем уровне число электронов больше в соответствии с распределением Больцмана, то преим. будет происходить резонансное поглощение энергии переменного магн. поля (его магн. составляющей).
Рис. 1. Расщепление энергетического уровня электрона в постоянном магнитном поле. Е 0 - уровень в отсутствие поля, Е 1 и Е 2 - уровни, возникающие в присутствии поля Н.
Для непрерывного наблюдения поглощения энергии условия резонанса недостаточно, т.к. при воздействии электро-магн. излучения произойдет выравнивание заселенностей подуровней (эффект насыщения). Для поддержания больцманов-ского распределения заселенностей подуровней необходимы релаксационные процессы. Релаксационные переходы электронов из возбужденного состояния в основное реализуются при обмене энергией с окружающей средой (решеткой), к-рый осуществляется при индуцированных решеткой переходах между электронными подуровнями и определяется как спин-решеточная релаксация . Избыток энергии перераспределяется и между самими электронами - происходит спин-спиновая релаксация . Времена спин-решеточной релаксации T 1 и спин-спиновой релаксации Т 2 являются количеств. мерой скорости возврата спиновой системы в исходное состояние после воздействия электромагн. излучения. Зафиксированное регистрирующим устройством поглощение электромагн. энергии спиновой системой и представляет собой спектр ЭПР.
Основные параметры спектров
ЭПР -
интенсивность, форма
и ширина резонансной линии, g-фактор,
константы
тонкой и сверхтонкой (СТС) структуры.
На практике обычно регистрируется 1-я,
реже 2-я производные кривой поглощения,
что позволяет повысить чувствительность
и разрешение получаемой информации.
Интенсивность линии определяется
площадью под кривой поглощения (рис. 2,
a), к-рая пропорциональна числу парамагн.
частиц в образце. Оценку их абс. кол-ва
осуществляют сравнением интенсивностей
спектров исследуемого образца и эталона.
При регистрации 1-й производной кривой
поглощения (рис. 2,б) используют процедуру
двойного интегрирования. В ряде случаев
интегральную интенсивность можно
приближенно оценить, пользуясь выражением
, где S пл -
площадь под кривой поглощения, I макс
- интенсивность линии,
- ширина линии. 1-я и особенно 2-я производные
(рис. 2, в)весьма чувствительны к форме
линии поглощения.
Форма линии в спектре
ЭПР сравнивается с лоренцевой и гауссовой
формами линии, к-рые аналитически
выражаются в виде: у= a/(1 + bх 2)(лоренцева
линия), у = а ехр (-bx 2)
(гауссова линия). Лоренцевы линии обычно
наблюдаются в спектрах ЭПР жидких р-ров
парамагн. частиц низкой концентрации
.
Если линия представляет собой суперпозицию
мн. линий (неразрешенная СТС), то форме
ее близка к гауссовой.
Рис. 2
, а - кривая
поглощения ЭПР, б - первая производная
поглощения, в -вторая производная
поглощения;
- ширина линии на полувысоте кривой
поглощения;
и I макс -
соответственно ширина и интенсивность
линии между точками максимального
наклона.
Важным параметром является
ширина линии
к-рая связана с шириной линий на
полувысоте
соотношениями
(лоренцева форма) и
(гауссова форма). Реальные линии ЭПР,
как правило, имеют промежуточную форму
(в центре лоренцева, по краям - гауссова
формы). Времена релаксации
T 1 и Т 2
определяют ширину резонансной линии
Величина T 1
характеризует время жизни электронного
спина
в возбужденном
состоянии
, в
соответствии с принципом неопределенности
при малых T 1
происходит уширениё линии ЭПР. В парамагн.
ионах
T 1 имеет
порядок 10 -7
- 10 -9 с и
определяет осн. канал релаксации
,
обусловливающий появление очень широких
линий (вплоть до таких, к-рые невозможно
наблюдать в обычных условиях). Использование
гелиевых т-р позволяет наблюдать спектры
ЭПР за счет увеличения T 1 .
В своб. орг. радикалах T 1
достигает порядка секунд, поэтому
главный вклад в ширину линии вносят
релаксационные процессы, связанные со
спин-спиновым
взаимодействием
и
определяемые временем Т 2 ,
обратно пропорциональным
где-
гиромагн. отношение для электрона
,-
параметр, зависящий от формы линии, в
частности=
1 для лоренцевой линии и
для гауссовой линии. Физ. смысл Т 2
заключается в том, что каждый электронный
спин
в системе создает локальные поля в
местах нахождения др. электронов
,
модулируя резонансное значение поля H
и приводя к уширению линии.
g-Фактор
формально определяется как фактор
спектроскопич. расщепления Ланде, равный
где L, S, J - квантовые числа соотв.
орбитального, спинового и полного
моментов кол-ва движения. В случае чисто
спинового магнетизма L= 0 (ситуация своб.
электрона
)
g = 2,0023. Отклонение от этой величины
свидетельствует о примеси орбитального
магнетизма (спин-орбитальное
взаимодействие
),
приводящего к изменению величины
резонансного поля. Ценную информацию
величина g-фактора дает при анализе
спектров ЭПР парамагн. ионов
с сильным спин-орбитальным
взаимодействием
, т.
к. она весьма чувствительна к лигандному
окружению иона
,
к-poe формирует кристаллич. поле (см.
Кристаллического
поля теория
). Для
ионов
g-фактор определяется в виде
где
- константа
спин-орбитального
взаимодействия
(или
спин-орбитальной связи),-т.
наз. расщепление в поле лигандов
.
Для орг. своб. радикалов величина
очень велика,
мала и отрицательна, поэтому для этих
систем g-фактор близок к таковому для
своб. электрона
и изменяется в пределах третьего знака
после запятой.
Магнитные взаимод. в
спиновых системах в общем случае
анизотропны, что определяется анизотропией
волновых ф-ций (орбиталей
)
неспаренного электрона
за исключением систем с неспаренным
электроном
в s-состоянии. Резонансное значение
магн. поля и величина g-фактора зависят
от относит. ориентации магн. поля и
кристаллографич. (или молекулярных)
осей. В жидкой фазе анизотропные взаимод.
усредняются, приводя к изотропному
(усредненному) значению g-фактора. В
отсутствие усреднения (твердая фаза) в
зависимости от структуры и хим. окружения
спиновой системы, реализуется цилиндрич.
(осевая) или более низкая симметрия
.
В случае цилиндрич. симметрии
различают
и
причем
- величина при поле Н, параллельном оси
симметрии
z,-
величина при H, перпендикулярном оси z.
Тонкая структура возникает в спектрах
ЭПР парамагн. ионов
,
содержащих более одного неспаренного
электрона
(S> 1/2). В частности дня иона
с S= 3 / 2
при наложении постоянного магн. поля
образуются 2S + 1 = 4 подуровня, расстояния
между к-рыми для своб. иона
одинаковы, и при поглощении кванта
должен наблюдаться один резонансный
пик. В ионных
кристаллах
за счет
неоднородности кристаллич. поля интервалы
между подуровнями спиновой системы
оказываются разными. В результате этого
поглощение электромагн. излучения
происходит при разл. значениях поля Я,
что приводит к появлению в спектре трех
резонансных линий.
Сверхтонкая
структура. Наиб. ценную информацию дает
анализ СТС спектров ЭПР, обусловленной
взаимод. магн. момента неспаренного
электрона
с магн. моментами ядер. В простейшем
случае атома
водорода
неспаренный электрон
находится в поле Н и локальном поле,
созданном ядерным спином
протона
(I=1/2); при этом имеются две возможные
ориентации ядерных спинов
относительно поля H: в направлении этого
поля и в противоположном, что приводит
к расщеплению каждого зеемановского
уровня на два (рис. 3). Т. обр., вместо одной
линии резонансного поглощения при
фиксированной частоте возникают две
линии.
Рис. 3.
Энергетические
уровни атома
водорода
в постоянном магнитном поле. Вертикальная
пунктирная стрелка показывает переход,
к-рый наблюдался бы в отсутствие СТВ.
Сплошные вертикальные стрелки
соответствуют двум переходам сверхтонкой
структуры. В спектре ЭПР (ниже схемы)
расстояние между линиями - константа
СТВ с ядром протона
.
M s и М I
- соответственно проекции спинов
электрона
и протона
,
связанные с их магнитными
моментами
.
Расстояние
между ними наз. константой
сверхтонкого
взаимодействия
(СТВ); для атома
водорода
а н = 5,12 x 10 -2
Тл. В общем виде при наличии СТВ
неспаренного электрона
с ядром, обладающим спином
I, линия поглощения ЭПР расщепляется на
(21+ 1) компонент СТС равной интенсивности.
В случае СТВ с и эквивалентными ядрами
в спектре возникают n + 1 эквидистантно
расположенных линий с отношением
интенсивностей, пропорциональным
коэффициентам биномиального разложения
(1 + x) n .
Мультиплетность
и интенсивность линий определяется
ориентацией ядерных спинов
в каждом конкретном случае, что видно
на примере спектра ЭПР метильного
радикала (рис. 4). Следует подчеркнуть,
что каждая линия спектра отвечает
совокупности частиц, имеющих одну и ту
же комбинацию ядерных спинов
,
создающих одно и то же локальное магн.
поле, а весь спектр -это статистическое
среднее по всему ансамблю спиновой
системы.
Различают два типа СТВ:
анизотропное, обусловленное диполь-дипольным
взаимод. неспаренного электрона
и ядра, и изотропное (контактное),
возникающее при ненулевой спиновой
плотности
неспаренного
электрона
в точке ядра. Анизотропное взаимод.
зависит от угла
между направлением поля H и линией,
соединяющей электрон
и ядро; его величина определяется ф-лой
где-
компонента магн. момента ядра вдоль
поля H, r -расстояние между электроном
и ядром. Анизотропное СТВ проявляется
в твердой и вязкой средах при беспорядочной
ориентации парамагн. частиц в виде
уширения компонент СТС и изменения их
формы. В маловязких средах это взаимод.
усредняется до нуля в результате быстрого
вращения частиц и остается только
изотропное (контактное) СТВ, определяемое
выражением
где-
ядерный магн. момент,
- спиновая
плотность
в точке
ядра, к-рая не обращается в нуль только
для электронов
в состоянии, т. е. для электронов
на s-орбитали или на соответствующей
молекулярной орбитали. В таблице
приведены рассчитанные значения макс.
контактного СТВ для s-электронов нек-рых
атомов
,
ядра к-рых обладают ненулевым магн.
моментом.
Рис. 4. Уровни сверхтонкой структуры и ориентации ядерных спинов для трех эквивалентных ядер со спином V, (протонов ) в переменном магнитном поле. Интенсивность линий в спектре ЭПР отражает вырождение по ориентациям ядерных спинов (показаны справа).
СВОЙСТВА АТОМОВ С МАГНИТНЫМИ ЯДРАМИ, КОНСТАНТЫ СТВ а НЕСПАРЕННОГО ЭЛЕКТРОНА С ЯДРОМ
|
Атом |
Массовое число |
Ядерный спин |
|||
В-электронных системах (большинство орг. своб. радикалов) спиновая плотность в точке ядра равна нулю (узловая точка р-орбитали) и реализуются два механизма возникновения СТВ (спинового переноса): конфигурационное взаимод. и эффект сверхсопряжения. Механизм конфигурационного взаимод. иллюстрируется рассмотрением СН-фрагмента (рис. 5). Когда на р-орбитали появляется неспаренный электрон , его магн. поле взаимод. с парой электронов -связи С - Н так, что происходит их частичное распаривание (спиновая поляризация ), в результате чего на протоне появляется отрицат. спиновая плотность , поскольку энергии взаимод. спинов и различны. Состояние, указанное на рис. 5, а, более устойчиво, т. к. для углеродного атома , несущего неспаренный электрон , в соответствии с правилом Хунда реализуется макс. мультиплетность . Для систем этого типа существует связь между константой СТВ с протоном и спиновой плотностью на соответствующем углеродном атоме , определяемая соотношением Мак-Коннела: где Q = -28 x 10 -4 Тл,- спиновая плотность на атоме углерода . Спиновый перенос по механизму конфигурационного взаимод. реализуется для ароматич. протонов и-протонов в орг. своб. радикалах.
Рис. 5. Возможные спиновые конфигурации для-орбитали, связывающей атом водорода во фрагменте С - Н, и р-орбитали атома углерода со спином а - спины на связывающей-орбитали и р-орбитали атома углерода параллельны, б - те же спины антипараллельны.
Эффект сверхсопряжения заключается
в непосредственном перекрывании
орбиталей
неспаренного электрона
и маг. ядер. В частности, в алкильньтх
радикалах СТВ по этому механизму
возникает на ядрах-протонов.
Напр., в этильном радикале на-протонах
СТВ определяется конфигурационным
взаимод., а на-протонах
- сверхсопряжением. Эквивалентность
СТВ с тремя протонами
метильной группы в рассматриваемом
случае обусловлена быстрым вращением
группы СН 3
относительно связи С - С. В отсутствие
своб. вращения (или в случае затрудненного
вращения), что реализуется в жидкой фазе
для мн. систем с разветвленными алкильньтми
заместителями или в монокристаллич.
образцах, константа
СТВ с-протонами
определяется выражением
, где-
двугранный угол между 2р z -орбиталью-углеродного
атома
и связью СН, В 0 4
x 10 -4 Тл
определяет вклад спиновой поляризации
по ядерному остову (конфигурационное
взаимод.), B 2 45
x 10 -4 Тл. В
пределе быстрого вращения а н
= 2,65 x 10- 3 Тл.
В спектроскопии
ЭПР триплетных состояний (S=1) помимо
электрон-ядерных взаимодействий (СТВ)
необходимо учитывать взаимодействие
неспаренных электронов
друг с другом. Оно определяется
диполь-дипольным
взаимодействием
,
усредняемым до нуля в жидкой фазе и
описываемым параметрами нулевого
расщепления D и E, зависящими от расстояния
между неспасенными электронами
(см. Радикальные
пары
), а также обменным
взаимодействием
(изотропным), обусловленным непосредственным
перекрыванием орбиталей
неспаренных электронов
(спиновый обмен), к-рое описывается
обменным интегралом J обм.
Для бирадикалов
,
в к-рых каждый из радикальных центров
имеет одно магн. ядро с константой
СТВ на этом ядре а, в случае быстрого
(сильного) обмена J обм а,
и каждый неспаренный электрон
бирадикальной системы взаимод. с магн.
ядрами обоих радикальных центров. При
слабом обмене (J обм а)регистрируются
спектры ЭПР каждого радикального центра
независимо, т.е. фиксируется "монорадикальная"
картина. Зависимость J обм
от т-ры и р-рителя позволяет
получить динамич. характеристики
бирадикальной системы (частоту и
энергетич. барьер спинового обмена).
Техника эксперимента. В спектроскопии ЭПР используют радиоспектрометры, принципиальная блок-схема к-рых представлена на рис. 6. В серийных приборах частота электромагн. излучения задается постоянной, а условие резонанса достигается путем изменения напряженности магн. поля. Большинство спектрометров работает на частоте v 9000 МГц, длина волны 3,2 см, магн. индукция 0,3 Тл. Электромагн. излучение сверхвысокой частоты (СВЧ) от источника К по волноводам В поступает в объемный резонатор Р, содержащий исследуемый образец и помещенный между полюсами электромагнита NS.
Рис. 6. Блок-схема спектрометра ЭПР. К - источник СВЧ излучения, В -волноводы, Р - объемный резонатор, Д - детектор СВЧ излучения, У - усилитель, NS - электромагнит, П - регистрирующее устройство.
В условиях резонанса СВЧ излучение
поглощается спиновой системой.
Модулированное поглощением СВЧ излучение
по волноводу (В) поступает на детектор
Д. После детектирования сигнал усиливается
на усилителе У и подается на регистрирующее
устройство П. В этих условиях регистрируется
и интегральная линия поглощения ЭПР.
Для повышения чувствительности и
разрешения спектрометров ЭПР используют
высокочастотную (ВЧ) модуляцию (обычно
100 кГц) внешнего магн. поля, осуществляемую
с помощью модуляционных катушек. ВЧ
модуляция и спец. фазочувст-вит.
детектирование преобразуют сигнал ЭПР
в первую производную кривой поглощения,
в виде к-рой и происходит регистрация
спектров ЭПР в большинстве серийных
спектрометров. В нек-рых спец. случаях
используют спектрометры, работающие в
диапазоне длин волн 8 мм и 2 мм, что
позволяет существенно улучшить разрешение
по g-фактору (своб. радикалы, парамагн.
ионы
).
Чувствительность совр. спектрометров
достигает 10 -9
М (10 11 частиц
в образце) при оптимальных условиях
регистрации и ширине линии 10 -4
Тл. Важной характеристикой является
временная шкала метода, определяемая
частотой СВЧ излучения, подающегося на
образец (v = 10 -10
с), что позволяет исследовать динамику
в спиновых системах в диапазоне частот
10 6 -10 10
c -1 .
Применение. Методом ЭПР можно определять концентрацию и идентифицировать парамагн. частицы в любом агрегатном состоянии , что незаменимо для исследования кинетики и механизма процессов, происходящих с их участием. Спектроскопия ЭПР применяется в радиационной химии , фотохимии , катализе , в изучении процессов окисления и горения , строения и реакционной способности орг. своб. радикалов и ион-радикалов , полимерных систем с сопряженными связями. Методом ЭПР решается широкий круг структурно-динамич. задач. Детальное исследование спектров ЭПР парамагн. ионов d- и f-элементов позволяет определить валентное состояние иона , найти симметрию кристаллич. поля, количественно изучать кинетику и термодинамику многоступенчатых процессов комплексообразования ионов . Динамич. эффекты в спектрах ЭПР, проявляющиеся в специфич. уширении отдельных компонент СТС, обусловленном модуляцией величины констант СТВ за счет внутри- и межмол. хим. р-ций, позволяют количественно исследовать эти р-ции, напр. электронный обмен между ион-радикалами и исходными молекулами типа А -* + А А + А -* , лигандный обмен типа LR * + L"L"R * +L, внутримол. процессы вращения отдельных фрагментов в радикалах, конформац. вырожденные переходы, внутримол. процессы перемещения атомов или групп атомов в радикалах и т.д.
Модификации метода.
В
двойном электрон-ядерном резонансе
(ДЭЯР) образец подвергают одновременному
воздействию СВЧ излучения и переменного
магн. поля в области частот ЯМР
.
При этом СВЧ излучение и постоянное
магн. поле поддерживаются в условиях
резонанса, а частота ЯМР
,
т. е. переменное магн. поле, обеспечивающее
реализацию ЯМР
при данном постоянном магн. поле, меняется
в диапазоне, отвечающем величинам СТВ
конкретной спиновой системы. При
выполнении условия ядерного резонанса
происходит изменение интенсивности
сигнала ЭПР. Спектр ДЭЯР, т. обр.,
представляет собой график изменения
интенсивности сигнала ЭПР в зависимости
от изменения частоты ЯМР
.
Метод значительно упрощает спектры
исследуемых объектов. Напр., если спектр
ЭПР радикала (С 6 Н 5) 3 С *
содержит 196 линий СТС, то в спектре ДЭЯР
регистрируется три пары
линий, отвечающих трем наборам протонных
констант
СТВ для этого радикала (орто-, мета-,
пара-протоны трех фенильных колец).
В
двойном электрон-электронном резонансе
(ДЭЭР) измеряют уменьшение интенсивности
одного сверхтонкого перехода при
одновременном насыщении (за счет большой
мощности соответствующей СВЧ частоты)
второго сверхтонкого перехода, т. е.
линий СТС, напр., в спектрах, изображенных
на рис. 4. Обе модификации ЭПР дают очень
точные значения констант
СТВ.
Метод электронного спинового
эха (ЭСЭ) заключается в воздействии на
спиновую систему коротких и мощных СВЧ
импульсов в условиях ЭПР и наблюдение
релаксации
возбужденной т. обр. системы в исходное
состояние. Помимо непосредственного
измерения времен релаксации
спиновой системы метод позволяет
получать информацию о скорости медленных
движений своб. радикалов.
Оптически
детектируемый ЭПР (ОД ЭПР) дает информацию
о своб. радикааах в радикальных
парах
, возникающих
при радиационном или УФ воздействии в
кристаллах
и жидкой фазе. Спиновое состояние
радикальной
пары
(синглетное или
триплетное) можно изменить вынужденным
путем, вызывая спиновые переходы
партнеров пары
под действием резонансного микроволнового
поля во внешнем магн. поле. Спектр ЭПР
при этом регистрируется путем изменения
выхода продуктов из радикальной
пары
любым аналит.
методом. Наиб. чувствительность получается
при использовании оптич. методов,
особенно по измерению люминесценции
.
При изменении напряженности магн. поля
записываемый спектр люминесценции
в точности повторяет спектр ЭПР радикалов,
возникающих в радикальных
парах
. Чувствительность
метода составляет 10-10 2
частиц в образце, что позволяет получать
сведения о спектрах ЭПР, строении и
превращениях короткоживущих радикалов,
время жизни к-рых составляет порядка
10 -8 с.
Явление
ЭПР открыто Е. К. Завойским в 1944.
Лит.: Вертц Дж., Болтон Дж., Теория п практические приложения метода ЭПР, М., 1975; Landolt-Bornstein, Numerical data and functional relationships in science and technology. New series, В., v. II/1, 1965-66, II/2, 1966, II/8, 1976-80,II/10, 1979, II/11, 1981, II/12, 1984, II/17, 1987-89.
Глава 6. Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса
6.1. Краткие основы метода
Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса(ЭПР) – это явление резонансного поглощения энергии электромагнитных волн парамагнитными частицами, помещенными в постоянное магнитное поле. Это поглощение возникает вследствие того, что неспаренные
электроны парамагнитных частиц ориентируются в постоянном магнитном поле так, что их собственный момент количества движения (спин) направлен либо по полю, либо против поля. Поглощение представляет собой функцию неспаренных электронов, содержащихся в
исследуемом |
Вследствие |
поглощения |
||||
высокочастотного поля образцом появляется сигнал ЭПР. Спектр ЭПР |
||||||
представляет собой зависимость поглощения микроволновой энергии от |
||||||
внешнего |
магнитного |
Поглощениепля |
||||
сверхвысокочастотного магнитного поля регистрируется либо на экране |
||||||
осциллографа, либо на самописце радиоспектрометра. |
||||||
рис. 6.1 приведена |
ЭПР-спектре |
|||||
гипотетического соединения.
радикала. Для этих целей составлены атласы спектров ЭПР различных соединений. Для интерпретации спектров ЭПР важны следующие параметры линий: форма, интенсивность, положение и расщепление.
Следует заметить, что приборы сразу же выдают первую производную кривой поглощения энергии (рис. 6.1).
Интенсивность линии ЭПР-спектра – это площадь под его кривой. Она пропорциональна числу неспаренных электронов в образце. За положение линии в спектре ЭПР принимается точка, в которой первая
~O -CH -O ~
Рис. 6.2. Схема появления сверхтонкого расщепления в ЭПР-спектре срединного радикала полиформальдегида
когда система |
содержит ядра с магнитным моментом, |
||||||
например протон (Н1 ), вблизи неспаренного электрона, на магнитный |
|||||||
момент электрона влияет ориентация магнитного момента. ядраВ |
|||||||
результате такого взаимодействия каждый магнитный энергетический |
|||||||
электрона |
расщепляется |
ПодуровнейЭто |
|||||
взаимодействие электрона и магнитного ядра называется сверхтонким |
|||||||
взаимодействием (СТВ), а |
расщепление |
энергетических |
уровней– |
||||
сверхтонким расщеплением (рис. 6.2). |
|||||||
6.2. Области применения ЭПР-спектроскопии в |
|||||||
макромолекулярной химии |
|||||||
ЭПР-спектроскопия |
макромолекулярной |
||||||
используется для изучения свободных радикалов, образующихся в следующих процессах:
· полимеризации (фото-, радиационное инициирование и т. д.);
· деструкции полимеров;
· окисление полимеров;
· расщепление макромолекул при механодеструкции.
6.3. Исследование структуры радикалов и молекулярных движений
Энергия СТВ неспаренного электрона с ядрами складывается из двух частей – изотропной и анизотропной. Так, изотропная часть определяет энергию дипольного взаимодействия электрона с ядром, и она зависит от угла между осьюр -орбитали неспаренного электрона и направлением постоянного магнитного поля. Анизотропное СТВ проявляется в спектре ЭПР радикалов в твердых телах, где ориентация радикалов жестко фиксированы. В жидкостях анизотропное СТВ отсутствует.
полиэтилена -CH 2 - CH - CH 2 - CH - (рис. 6.3).
В поликристаллическом полимере спектр состоит из шести линий
(рис. 6.3, а ). Это |
обусловлено тем, что |
взаимодействие |
неспаренного |
|||
электрона |
осуществляется |
|||||
магнитноэквивалентными |
протонами, |
константы |
||||
примерно одинаковы. |
||||||
Рис. 6.3. Спектры ЭПР срединного радикала полиэтилена в поликристалле (а ) и в монокристалле при ориентации оси макромолекулы вдоль поля (б ) и перпендикулярно полю (в )
Однако спектр полиэтилена ориентированного, в котором зигзаг цепи полимера расположен вдоль направления поля, уже имеет пять линий (рис. 6.3, б ). Этот ЭПР-спектр обусловлен взаимодействием неспаренного электрона только с четырьмя протонами. Взаимодействие с α-водородом в этой ориентации мало и не проявляется в спектре.
Если теперь повернуть поле и направить его вдольр -орбитали, перпендикулярно зигзагу цепи, то появляются 10 линий (рис. 6.3, в ). Удвоение числа линий связано с расщеплением на α-протоне, которое при этой ориентации достаточно велико.
Рис. 6.4. Спектры ЭПР срединного ~CH2 - C H - CH2 ~ (а ) и концевого
~CH2 - C H2 (б ) макрорадикалов полиэтилена
В полиэтилене цепи имеют плоскую конформацию, и поэтому в срединном радикале все пять протонов, ближайших к реакционному центру радикала, магнитно эквивалентны. Спектр ЭПР такого радикала (рис. 6.4, а ) состоит из шести линий, распределение интенсивностей которых описывается биномиальным законом. Спектр ЭПР концевого радикала состоит из пяти линий (рис. 6.4, б ).
6.4. Исследование химических процессов в полимерах
Метод ЭПР используется для обнаружения, радикалов исследования их превращений и радикальных реакций в полимерах.
Для исследования химических процессов важно не только идентифицировать радикалы, но и измерить их концентрации. Прямое определение свободных радикалов с помощью ЭПР в ходе свободнорадикальной полимеризации в настоящее время не совсем успешно. Это обусловлено тем, что при обычных экспериментальных скоростях полимеризации концентрация радикалов очень мала.
Методом ЭПР идентифицированы растущие макрорадикалы в жидкой и твердой фазах, определены их концентрации, найдены константы скорости роста и обрыва цепей.
